摘要：目的研究酪氨酸磷酸酶抑制剂过钒酸钠（pervanadate，per）对电离辐射作用后细胞线粒体膜电位(δψm)改变和细胞凋亡的影响。方法应用流式细胞仪测定电离辐射作用后鼠源性髓系白血病细胞株bet-2细胞线粒体膜电位及其在过钒酸钠干预后的改变和细胞凋亡水平。结果电离辐射早期可引起bet-2细胞线粒体膜电位降低，诱导细胞凋亡发生；过钒酸钠在一定程度上稳定细胞线粒体膜电位，减少细胞凋亡。结论过钒酸钠可逆转电离辐射诱导的细胞线粒体膜电位的降低，减少造血细胞凋亡的发生。
关键词：bet-2细胞；电离辐射；线粒体跨膜电位(δψm)；细胞凋亡；过钒酸钠
effectsofpervanadateonmmpofbet-2cellsinducedbyionizingirradiation
yanglong,wangyi-ping,rongshu,etal.
instituteofmilitarymedicalresearchcenterofnanjingmilitarydistrict(nanjing210002,china)
abstract：objectivetostudytheeffectsofpervanadate(per),theinhibitorofproteintyrosinephosphotasesonthealterationsofmitochondrialmembranepotential(mmp)sbet-2cellsweredividedintoper-trsafterirradiationwasgiven,themmpofbet-2cellswasreducedintheearlystagesignificantly,andtheapoptosisappeared,entlyenhancedthemsionperreversedtherepressionofmitochondrialmembranepotentialandsuppressapoptosisinducedbyionizingirradiationinthehematopoieticcells.
keywords：bet-2cell;ionizingirradiation;mitochondrialmembranepotential(mmp,δψm);apoptosis;pervanadate(per)
细胞凋亡是电离辐射导致造血系统损伤的主要方式。预防与控制造血干/祖细胞大量凋亡，有效恢复机体造血功能，在未来可能爆发的核事故、核战争以及肿瘤放射治疗副反应控制等领域都具有十分重要的意义〔1〕。造血细胞信号转导过程受蛋白质酪氨酸磷酸酶（proteintyrosinephosphotases，ptp）的调控〔2〕。过钒酸钠（pervanadate，per）作为ptp特异性抑制剂，参与细胞内多条信号通路信息的传递过程的调节〔3〕。通过改变ptp活性调控造血细胞受体信号转导通路，可能成为继重组人粒细胞集落刺激因子（g-csf）、促红细胞生成素（epo）、重组血小板生长因子（tpo）等细胞因子之外的促进辐射造血损伤修复的发展方向〔4〕。本研究观察per对照射后bet-2细胞线粒体膜电位改变及细胞凋亡的影响，探讨调控造血细胞受体信号通路中ptp活性对造血细胞电离辐射损伤的保护作用。结果报告如下。
1材料与方法
11材料
111bet-2细胞bet-2细胞为促红细胞生成素（epo）依赖的鼠源性髓系白血病细胞株(军事医学科学院第3研究所张明伟惠赠)。悬浮于含10％马血清的1640完全培养基中，加入epo至终浓度为2u/ml，置37℃，5％co2孵箱培养，隔日换液，取指数生长期细胞用于试验。
112主要试剂与仪器罗丹明123、四甲基偶氮噻唑蓝(mtt,美国sigma公司)。原钒酸钠（navo3）、双氧水（h2o2）：用双蒸水配制为200mmol/l的储存液，过滤除菌，4℃保存。促红细胞生成素（epo）活性为1×105u/mg，纯度>95％，由北京放射医学研究所汤仲明教授提供。model450型酶联仪（美国bio-rad公司）；facscalibur型流式细胞仪（美国bectondickson公司）。
12方法
121照射条件军事医学科学院放射医学研究所60coγ射线照射源，一次照射剂量分别为3，5gy，剂量率为148～157gy/min。
122per制备〔5〕将200mmol/l原钒酸钠50μl及200mmol/lh2o250μl加入400μl1640培养液中，21℃水浴反应15min，加入5μlh2o2酶终止反应。用1640培养液稀释成应用液现配现用。
123mtt方法将待测细胞用rpmi1640培养液洗涤3次，台盼兰染色计数活细胞，用上述完全培养基分为无per组及per实验组（per终浓度为5μmol），调整细胞浓度至3×105/ml，每孔100μl加入96孔板中；per用rpmi1640递减稀释后，每孔加入100μl，每组做3个复孔，37℃培养48h，加mtt(50mg/ml)20μl，继续培养4h，离心，弃上清，加入200μl二甲基亚砜（dmso），振荡助溶，在model450酶联仪上测492，630nm双波长的a值，以per浓度指数为横坐标，以a值纵坐标绘图。应用originversion294软件中logistic程序进行拟合处理分析。
124细胞线粒体膜电位(△ψm)测定〔6〕取1×105细胞，pbs洗涤2次，加入罗丹明123储存液至终浓度为10μmol/l，室温下平衡30min，pbs洗涤3次，pbs稀释至细胞浓度为1×105/ml，上机检测，激发光波长为488nm，计数1×104个细胞，测定细胞相对荧光强度，数据经流式细胞仪kolmogorov-smirnovstatistic
125细胞凋亡检测按德国宝灵曼公司annexin-v-fluos凋亡分析试剂盒说明书进行。取约1×106细胞，pbs洗涤，200g×5min，弃尽上清，重悬于100μlannexin-v-fluos标记缓冲液［1000μl溶液ⅲ中预先加入20μlannexin-v-fluos单抗及20μl50μg/ml溴化丙锭(pi)］中，避光，室温放置10～15min，加溶液ⅲ(100mmolhepes/naoh,ph74,140mmolnacl,5mmolcacl2)04ml，上机检测。
2结果
21bet-2对epo细胞增殖反应性（图1）培养基中epo浓度<05u/ml时，bet-2细胞增殖停止；在1～2u/ml之间即有良好促增殖作用；epo浓度>4u/ml，其促增殖能力已达饱和。表明bet-2细胞对epo有较好的依赖性，保持了稳定的生物学特性。
图1bet-2对epo的增殖反应性（略）
22per对bet-2细胞增殖反应性（图2）当per浓度<005μmol/l时，对细胞无明显效果；per≥625μmol/l时，导致细胞死亡；而在1～3125μmol/l时可明显促进bet-2细胞在缺乏epo状况下的增殖。提示适量per具有细胞因子样作用，可促进bet-2细胞增殖。因此，在下述实验中，使用per的终浓度为5μmol/l。
图2bet-2对per的增殖反应性（略）
23per对电离辐射所致bet-2细胞增殖抑制的影响（图3）对于未照射的bet-2细胞，适当浓度per可明显促进bet-2细胞在缺乏epo状况下的增殖；对于5gyγ射线照射后的bet-2细胞，1～3125μmol/l的per仍能明显促进bet-2细胞在缺乏epo状况下的增殖。提示电离辐射可能导致细胞信号转导过程中负调控―酪氨酸磷酸酶作用的增强，抑制细胞的增殖。
24per对电离辐射后bet-2细胞mmp改变的影响未处理的bet-2细胞相对荧光强度为18111±899，3gy照射细胞相对荧光强度为16420±870，5gy照射细胞相对荧光强度为13093±910，组间比较差异均有统计学意义(p<001)，表明随着照射剂量增加，细胞线粒体膜电位(△ψm)呈逐渐下降的趋势。5gy照射12h后细胞相对荧光强度为10263±856，而照射即刻加入per（终浓度为5μmol/l），细胞相对荧光强度为16837±915(未处理的bet-2细胞相对荧光强度为18359±1422)，组间比较差异有统计学意义(p<001)，表明per可明显缓解照射后bet-2细胞线粒体膜电位(△ψm)下降的程度。
25per对电离辐射后bet-2细胞凋亡的影响5gy照射后12h,存活细胞（ll象限）比例为6729%,凋亡及坏死细胞（ul+ur+lr象限）达到3271%；照射后即刻加入per（终浓度为5μmol/l）,存活细胞9343%，凋亡及坏死细胞仅为657%，组间比较差异有统计学意义（p<001），表明per可显著减少照射后bet-2细胞凋亡的发生。
图3照射前后bet-2细胞对per增殖反应性（略）
3讨论
研究表明,凋亡细胞在表现出明显的核凋亡之前，线粒体失去其跨膜电势-线粒体膜电位（mmp），这种膜电位的崩解出现在许多类型的细胞中。线粒体膜电位的改变是细胞凋亡效应阶段前的一个重要标志〔6,7〕。本研究结果表明,电离辐射可导致鼠源性epo依赖的bet-2细胞线粒体膜电位(△ψm)下降，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡。而在照射后即刻加入适量ptp特异性抑制剂per，则可明显缓解受照后bet-2细胞线粒体膜电位(△ψm)下降趋势，显著减少电离辐射诱导的细胞凋亡，有效促进受到辐射损伤bet-2细胞的存活、增殖。per对辐射损伤后的bet-2细胞有一定的保护作用。结果提示，电离辐射可能直接或间接地激活了蛋白质酪氨酸磷酸酶(ptp)负调控过程，从而引发造血细胞受体增殖信号抑制，导致细胞线粒体膜电位(△ψm)下降，可能是辐射诱导细胞凋亡的机制之一〔8〕。
参考文献
〔1〕罗庆良，从玉文，郝静，等.造血因子与急性放射病［j］.解放军医学杂志，2005，30（3）：186-190.
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〔3〕edux:revisitingptpsandthecontrolofcellsignaling［j］.cell，2005，121(5):667-670.
〔4〕lawsonae，baoh，wickremaa，ataseinhibitionpromotesantiapoptoticbutnotproliferativesignalingpathwaysinerythropoietin-dependenthcd57cells［j］.blood，2000，96(6):2084-2092.
〔5〕从玉文，陈家佩，邵源.辐射后造血细胞对造血因子增殖反应性变化的研究〔j〕.军事医学科学院院刊，1999，23（2）：119-122.
〔6〕张海涛，张海风，祝其锋，等.鲎血细胞多肽诱导hl-60细胞凋亡时线粒体膜电位的变化〔j〕.
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